高效液相色谱仪原理及操作步骤和注意事项【图文】-凯发k8国际科技

高效液相色谱仪原理及操作步骤和注意事项【图文】

更新时间：2025-06-30

高效液相色谱仪是是一种基于经典液相色谱法，结合气相色谱理论和实验技术的新型液相色谱分析法，广泛应用于药物分析、环境检测、食品安全及生化研究等领域。其核心原理是通过高压驱动流动相携带样品通过固定相色谱柱，利用各组分在两相间分配系数的差异实现分离，并由检测器定量分析。凯发k8国际为您整理HPLC的工作原理、标准化操作步骤及使用注意事项，确保实验的准确性与仪器的高效运行。

高效液相色谱原理

高效液相色谱仪(HPLC)是应用高效液相色谱原理，主要用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定的和分子量大的有机化合物的仪器设备。它由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相) 内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中做相对运动时，经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

高效液相色谱仪操作工序：

一：配置好实验所需的流动相(甲醇:水=8:2)和纯甲醇，经过滤超声后备用。

二：打开泵电源。将泵的压力上限设置为40MPa。(已设定好，可不用再设定)

1.将泵的过滤头轻轻放入到新配好的纯甲醇中，设置流量为1ml,然后按“启动/停止”键开始走液，经过10-20分钟后按“启动/停止”键停止走液。

2.将泵的过滤头轻轻放入到新配好的甲醇水中，然后按“启动/停止”键开始走液。

3.打开检测器电源，调整好检测器的波长280(已设定好，可不用再设定)，然后按“调零”键调零。

三：打开电脑上的UC-3268色谱工作站，左上方出现握手图标，说明工作站已连接仪器。然后查看基线等基线走直即可进样。

四：进样之前先看基线在不在界面内，如果不在按“调零”键调零，之后再开始进标样，将液体进样阀扳到“LOAD”位置，将标样打入液体进样阀内，再把液体进样阀扳到“INJECT”位置,此时工作站已启动，等峰出完后点“停止”键。

五:做校正曲线

1.编辑定量参数点击“定量参数”图标，弹出方法编辑窗口：设置好“定量方式：（峰面积）”、“定量方法（外标法）”、“标准（1个浓度标样，选‘1点’”）、“次方（1次）”、“标样浓度单位（%）”、“样品结果单位（%）”。

2.填写组份表

点击“组份表”图标，弹出方法编辑窗口，填入所分析的样品组份名称（辣椒素）、保留时间（5.2分钟左右）及标准浓度（100）。

3.定义校正曲线

点击“校正曲线”图标，弹出方法编辑窗口。定义各点对应的色谱峰文件。即先用鼠标指向标样点号，然后单击左键，则该点号被蓝框覆盖，再单击右键，弹出右键可选菜单：

选择“增加”项（此项操作即表示同一个浓度点，可以加入几个平行实验的数据进来进行平均计算），弹出“谱图选择”窗口。然后在此选择相应的谱图文件，则该序号点的文件前出现一个“+”号。各个点定义完成后，单击“重校正”即可显示出校正曲线。点“确认”键。

六:进样品，出完峰后点停止，点屏幕报告即可查看结果。如有多个样品，可重复进样品此步骤即可。

七:查看以前样品结果

进入“再处理”界面，点击“打开数据文件”图标，弹出“谱图选择”窗口在此选择样品谱图文件，如下：

然后要单击“重新计算”按钮，再点击“屏幕报告”图标，即可看到屏幕报告表：

八:关机

关闭检测器电源，按“启动/停止”键停止泵运行，将泵的过滤头轻轻放入到新配好的纯甲醇中，按“启动/停止”键开始走液，经过10-20分钟，泵压力稳定后，按“启动/停止”键停止走液，关闭泵电源。电脑不用可提前关闭。

液相色谱仪结构:

1、溶剂输送系统；储液器，用来贮存数量足够、符合要求的流动相。配有溶剂过滤器，以防止流动相中的颗粒进入泵内。脱气器，脱气的目的是为了防止流动相从色谱柱内流出时释放出气泡进入检测器，从而引起噪声，不能正常检测。

输液泵，将储液器中的流动相连续不断地以高压形式进入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。梯度洗脱装置，是在分离过程中通过逐渐改变流动相的组成增加洗脱能力的一种装置。

2、进样系统；进样器：是将样品送入色谱柱的装置，进样方式可以分为两种：阀进样或自动进样。比较常用的是采用自动进样器装样。

3、分离系统；色谱柱：对样品进行分离，是整个色谱系统的心脏，它的质量优劣直接影响到分离的效果。

4、检测系统；检测器：将色谱柱连续流出的样品组分转变成易于测量的电信号，被数据系统接收，得到样品分离的色谱图。

5、数据处理和记录系统；对色谱数据进行处理，并参与HPLC仪器的自动控制。

液相色谱仪注意事项：

1、泵正常工作时，在流动相和流速不变的前提下柱压应该是稳定的，当然在换流动相时压力变化是正常的，正常情况下如果柱压升高基本上都是由色谱柱使用时间长引起的（只有更换色谱柱），如果正常情况下压力突然降低有可能是（1）接头处有漏液的地方，采取的方法是有滤纸检查，如有漏液的地方用扳手拧紧即可。如果没有漏液则可能是（2）白色的管子里面有气泡从而导致流动相进不到泵里面去，采取的方法是排气泡。排气时:先STOP停泵--打开排气阀--按PURGE（快冲）键--等气泡排完后先STOP停泵--拧紧排气阀，其先后步骤不要搞反了。

2、泵正常工作时最高压力最好不要超过200KG，所以打开泵以后可以将泵的zui大压力调到200KG，这样如果压力超过上限则会自动报警停机，流速zui好不用超过1ML/MIN，如果使用时压力超过200KG，建议将流速调低点以降低压力（在色谱柱正常的情况下），如果是因为色谱柱长时间使用造成压力升高则建议更换色谱柱（因为色谱柱属于耗材长时间使用就需要更换，更换的主要依据色谱柱出峰不正常或者柱压力过高）。

3、泵正常工作时平均每15天左右向注油孔加润滑油2-3滴。

4、流动相里面如果有盐或酸类，做完实验后要先用95%二次蒸馏水与5%甲醇洗色谱柱40分钟左右，然后用纯甲醇洗30分钟左右才可以关机。第二天如果继续做实验流动相里面仍旧有盐或酸类，zui好先用95%二次蒸馏水与5%甲醇过渡20分钟，再用流动相。如果流动相里面只有甲醇，水，乙腈，做完实验后就不用95%二次蒸馏水5%甲醇冲洗，可直接用纯甲醇洗30分钟即可关机。

5、色谱柱的耐酸PH值范围3-8使用时不要超出。

6、仪器长期不用时一定要将滤头泡在甲醇里半月开机一次，如果开机时泵抽不上液可以打开排气阀按PURGE快冲。

7、调反压器时要注意等液体流出来以后才能调，一般调8--10KG，比如现在泵显示屏显示柱压50KG那再增加10KG显示屏上显示柱压60KG然后拧紧锁紧螺母。

8、关机顺序：清洗液路时可以把检测器直接关机，清洗结束后先按STOP让泵停止后再关电源，不允许直接关机

凯发k8国际30年来始终专注于色谱技术的研发与应用，构建了涵盖“实验室理化分析、新兴生物技术上游纯化、临床分析检测”三位一体的业务布局。其产品线广泛覆盖实验室分析、生物制药纯化及临床检测等领域，包括1100/3100/3200/3200L系列高效液相色谱仪、色谱工作站软件、MS? Vertical 9100三重四极杆质谱仪、气相色谱仪、制备纯化色谱系统、计量泵、色谱柱及其配件等核心产品。经过三十年的技术积累，公司持续深化色谱技术在各领域的应用，推动分析检测与纯化技术的创新发展。

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